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A1: 目前培養的類器官主要來源于上皮細胞，對于非上皮細胞來源的類器官培養方式還需要進一步研究。

A2: 常見的類器官根據起始細胞的類型，可以分為兩種：

（1）腫瘤組織來源的腫瘤類器官；

（2）干細胞來源的類器官，包括：多能性干細胞 (PSC) /成體干細胞 (ASC)以及誘導多能干細胞(iPSC)。

A3: 類器官并不是單一細胞組成的結構，而是由具有干細胞性質的起始細胞進行分裂和分化，并將多種類型的細胞自組裝的結構，自組裝后的形態和功能與體內相應器官相似。

A4：可以的。已有學者驗證過，將人結腸癌、甲狀腺癌、肺癌、腎癌和肝癌的手術組織切碎后，以梯度降溫的方式進行冷凍，最終在液氮中保存15-18個月后進行復蘇和原代細胞提取，分別對細胞進行2D和3D培養，證實了凍存對于細胞活力和生長速度均無顯著影響^【1】。

當然，由于組織來源不同、凍存條件不同，還需要大家根據實際情況進行驗證，新鮮組織提取的細胞依然是3D培養的最佳選擇。

A5：類器官可以凍存，通常會在傳代2-3次之后選擇凍存。為了達到最佳的效果，可以選擇類器官成熟（傳代7-10次）后再進行凍存。

A6：是的，主要的原因是類器官內部缺乏循環系統。

當類器官的尺寸較大時，靠近中心的細胞難以和外界進行氧氣和營養成分的交換。因此這個結構尺寸越大，死亡的細胞就越多（如圖1）^【2】。我們在培養的過程中，需要控制類器官的大小在4-5mm以內。未來的類器官技術可以與血管類器官結合在一起，建立一個功能性的封閉循環系統，用以培養出更大尺寸的類器官。

A7：類器官的傳代通常是根據培養的時間判斷。一般在7-14天時進行第一次傳代，后續則每7-10天傳代一次^【3】。

A8：大部分類器官可以在體外連續傳代10次（>6個月），甚至有些類器官可以連續傳代20次（>12個月）并且維持原有的生長速度^【4】。

A9: 初步可以通過顯微鏡和H&E染色觀察形態；然后可以用Western Blot、qRT-PCR、免疫熒光、流式細胞術檢測該類器官是否表達相應的biomarker；基因測序可以鑒定所培養的類器官是否有某些特征丟失；對于部分類器官，還可以檢測其是否具有功能，例如：已有研究檢測出胃類器官可以分泌胃酸，心臟類器官可以自主跳動。

A10: 在進行類器官培養前，我們需要了解該器官在體內的發育過程，及早期發育相關的信號通路。

以胃類器官培養為例：胃由前后腸發育而來，早期發育需要由多種信號通路共同調控。那么在體外我們需要通過添加細胞因子的方式，指導激活/抑制相應的信號通路，來達到相同的效果，如：PSCs在Activin A的作用下分化為內胚層，Wnt3a、FGF-4和Noggin指導細胞向向前腸分化^【5】。

A1: 類器官是由不同類型的細胞組成的結構，并且在體外是自組裝的，因此很容易存在同一樣本在相同培養條件下的孔間差異。

如果是用于患者個性化醫療的腫瘤類器官，需要更精準地模擬患者體內的特征，這種情況建議采用多個平行來減小差異；

如果是用于機制研究或用作疾病模型的類器官，可以考慮利用“微流控液滴技術”進行工程化培養，相關成果已發表在Cell Reports Medicine^【1】。

A2：已有動物實驗證實過可行性，比如：腸類器官移植小鼠治療潰瘍性結腸炎^【2】；胰島類器官移植小鼠治療糖尿病^【3】。

雖然目前類器官移植尚未進入臨床，但在2021年2月，Science^【4】首次報道了利用膽道類器官修復離體條件下的人類肝臟，實現了膽道再生，并改善了膽汁性質。

A3：這個問題可以在Nature Protocols^【5】找到答案。

對于新鮮培養的類器官：建議對低代次類器官（2-3代）進行藥物篩選，以最大限度地減少使用過的培養基或體外突變累積對藥物測試的影響。

對于經過凍存的類器官：由于冷凍/解凍可能導致復蘇時器官樣形態的變化，因此建議類器官至少傳代一次再進行藥物篩選。如果出現復蘇后細胞活力不佳，則需要延長培養時間以恢復細胞狀態。

A4：1、判斷形態。顯微鏡下類器官形態可能為空泡狀、出芽狀、緊密型、松散型等，但整體形態一致。

2、可以鑒定相應的biomarker是否有表達，及分布是否與組織切片相似。

3、是否能夠傳代3次以上，并可以凍存復蘇。

4、如果有條件的話，可以進行測序分析。

A5：可以，干細胞來源類器官的基因編輯多用于疾病建模，而腫瘤來源的類器官則多用于尋找疾病相關突變點或治療靶點，圖1列舉了類器官基因編輯的部分研究和應用。

A6：1、細胞來源有區別：類器官的細胞來源是具有多能性的上皮細胞，而普通細胞培養適用于培養多種類型細胞；

2、 細胞培養方式不同：1）類器官需要基質膠等材料支撐其三維結構，普通細胞培養則不需要；2） 類器官需要實現體外分化和自組裝，因此需要多種細胞因子的組合進行誘導，培養基成分復雜。而普通細胞培養通常為單一種類細胞，因此培養基成分較簡單；

A7：通常來講，如果腫瘤發生了轉移，我們依然選用相對應的原發灶（A類型）PDO培養基。

A8：類器官的分化方式本質上是在模擬體內的器官發育，因此表達形態及各細胞分布情況與實際器官具有相似性，而細胞團則沒有這種規律。我們可以通過免疫熒光的方式檢測biomarkers的分布情況來區分。例如下圖中的結果表明，腎類器官與腎組織的biomarkers分布高度一致^【7】。

A9：由于類器官涉及到體外分化和自組裝，因此來源細胞必須具有多能性。正常組織的成熟體細胞中往往會有一部分成體干細胞（標志物為Lgr5，CD133等），這部分細胞也可以進行類器官培養。

A10：依據Hans Clevers實驗室早期發表的文章，可以采用條件性培養基代替純化的細胞因子進行類器官培養，但同時也需要考慮條件性培養基的不足之處。小編總結了條件性培養基和近岸細胞因子的參數差異。

A2：考慮到DMSO這類有機物的細胞毒性，建議終濃度不超過0.1%（v/v）。

A3：黑色小顆粒大概率是雜質或細胞碎片，去除它們有以下兩種方式可以參考：

1、將類器官消化下來，用培養基進行反復清洗，達到稀釋雜質的作用；

2、用無菌手術刀將類器官切成兩半，取1ml注射器吸滿培養基并輕輕推出，沖洗類器官中的雜質^【2】。

A4：PDO、PDX、PDXO模型有各自的優勢，通常有以下兩種結合方式：PDO-PDX和PDX-PDXO。

1、PDO-PDX是性價比更高的方式，即：先利用PDO進行高通量的藥物篩選，篩選出有效的藥物再進行PDX測試。

2、PDX-PDXO是更精準的藥物測試方式，即：先利用PDX產生大量的體內腫瘤，然后將這些腫瘤分離進行PDXO培養，此時可以通過PDX模型，將PDXO的藥敏實驗結果與體內用藥結果一一對應，進而預測人體用藥的結果，實現對患者更精準的用藥指導；并且可以用PDX模型將轉移后的腫瘤分離，同樣進行PDXO培養和用藥，能夠更精確地對轉移灶進行藥物篩選。

A5：1、將類器官放置在冰上，待基質膠融化后離心進行回收，這種方式適用于不需要將類器官結構完全打散的情況；

2、市售的細胞回收液，可以溫和有效地獲得細胞懸液，不會損傷細胞或細胞表面蛋白。

A6：基質膠能夠為類器官提供支撐作用，目前類器官培養用的基質膠來源于小鼠肉瘤的基底膜基質，其中含有約60%層粘連蛋白、30% IV 膠原和8%的巢蛋白，還含有基底膜聚糖、TGF-?、表皮生長因子、類胰島素生長因子、組織纖溶酶原等1800多種獨特的蛋白質。由于基質膠中各因子的不確定性，并且存在批次間差異，因此目前也有一些聚焦于基質膠替代方案的研究，如圖2^【3】。

A7：1、根據所模擬的器官自身生長情況選擇，例如：皮膚的正常生長是有一面需要接觸空氣，那么對于皮膚類器官的培養傾向于利用氣-液交互法來培養^【4】；

2、考慮所培養的類器官模型的應用方向，例如：氣-液交互法培養易于進行病毒感染實驗，因此用于病毒感染實驗的氣道類器官會優先選擇氣-液交互法培養^【5】。

A8：藥物篩選前，通常將類器官吹散后，用含2%-5%基質膠的培養基懸浮，并最終鋪在基質膠包被的孔板中^【6-7】。

A9：建議采用水平轉子代替角轉子，可以有效減少類器官掛在離心管壁的情況。

A10：1、抗體藥物因為需要免疫細胞的參與，因此腫瘤類器官不能篩選抗體類藥物，此類藥物篩選需要構建腫瘤類器官-腫瘤微環境的模型來實現；

2、由于腫瘤類器官中沒有對血管進行培養，因此抗血管類的藥物也同樣不能進行篩選。