關于酵母雙雜
歷史極
酵母雙雜交系統，又稱蛋白阱捕獲系統，是由Fields和 Song等人根據真核轉錄調控的特點創建的。利用酵母雙雜交系統能夠快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用，并能尋找、分離與已知蛋白相互作用的配體，在研究抗原和抗體相互作用、發現新的蛋白質和發現蛋白質的新功能、篩選藥物作用位點及藥物對蛋白互作影響、建立基因組蛋白連鎖圖等方面應用廣泛。
原理
酵母雙雜交系統的建立是基于對真核生物轉錄調控過程的認識。真核生物中基因轉錄需要轉錄激活因子的參與，真核生物的轉錄激活因子含有兩個不同的結構域。轉錄因子通常含有兩個獨立的結構域:DNA結合域(BD)和轉錄激活域(AD)，只有當這兩種結構域共同作用時才能使轉錄正常進行。
利用此特性，可以分別使BD與AD同“誘餌”蛋白(X)和“獵物”蛋白(Y)形成融合蛋白，一般把用來進行篩選的目的蛋白稱為“誘餌”蛋白，而篩到的陽性克隆稱為“獵物”蛋白。單獨的BD與AD蛋白質游離于細胞中不同的位置而分開，不能激活報告基因的轉錄。如果兩種蛋白X和Y可以發生相互作用，就能使BD與AD在空間上充分接近，從而激活報告基因的轉錄。判斷通過報告基因表達與否，即可判斷兩蛋白之間是否存在相互作用
圖1：酵母雙雜交原理
判斷互作
如何判斷是否存在相互作用？
報告基因作為一種營養標記，常用的有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等，對應的宿主菌則是相應標記的缺陷型細胞，必須要在含有該營養標記的培養基中生長。因此，當有相互作用的蛋白存在時，激活報告基因的表達，從而能夠在不含營養標記的培養基中生長，以此驗證是否存在相互作用。
組成部分
酵母雙雜交系統由三個重要元件組成：
與DNA結合結構域（BD）融合的蛋白表達載體（BD-X），被表達的蛋白稱為誘餌蛋白（bait）或稱為誘餌，通常誘餌蛋白為已知蛋白。
與轉錄激活結構域（AD）融合的蛋白表達載體（AD-Y），被其表達的蛋白稱為靶蛋白（prey）或稱為獵物，靶蛋白可以為cDNA文庫、基因片段或基因突變體等。
帶有一個或多個報告基因的宿主菌株。
常用的報告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等，而菌株則需具有相應的缺陷型（如果報告基因為HIS3，則菌株應為HIS3的缺陷型。雙雜交質粒上帶有特定的抗性基因和營養標記），一個菌株可以含有1個、2個或多個報告基因。
應用
(1) 檢驗一對已知蛋白(或結構域)間的相互作用；
(2) 用已知功能的蛋白基因篩選 cDNA 文庫，尋找互作蛋白，根據釣到的基因功能推測該新基因作用網絡。
酵母雙雜交系統主要應用于快速驗證已知蛋白之間的相互作用或尋找新的相互作用蛋白質，尤其在尋找蛋白質互作區域時相當有優勢。
其優點有：
(1)采用高拷貝和強啟動子的表達載體使目的蛋白過量表達，方便復合物的形成；
(2)篩選過程在真核酵母活細胞內進行，一定程度上反映了體內的真實情況；
(3)檢測的結果是基因表達產物的級聯效應，通過mRNA產生多種穩定的酶使信號放大，因而可檢測存在于蛋白質之間的微弱的或暫時的相互作用，而細胞內的免疫共沉淀依賴于兩個互作蛋白質的解離程度，因為在免疫沉淀的過程中通過洗滌的過程降低了互作信號；
(4)文庫來源廣泛，可采用不同組織、器官、細胞類型和特殊分化時期材料構建成cDNA文庫。
缺點有：目前的酵母雙雜交方法存在操作復雜，假陽性和假陰性多，結果主要為定性數據，不易精確判斷蛋白質相互作用的強度等問題。酵母雙雜交結果需要再用其他方法進行進一步確認。
實驗流程
以GaL4系統為例的酵母雙雜實驗流程
1. 挑活化好的酵母菌株AH109單克隆，接種于5 mL YPDA液體培養基中。
2. 30℃，250 rpm，培養16-18 h。
3. 按每個反應10 mL的菌量計算所需的培養基體積。將過夜培養物轉接入適量的YPDA液體培養基，30℃，250 rpm，培養至OD600為0.4-0.6。在30℃時，酵母約為2.5 h一代，可據此計算接入的菌量。
4. 開始收集菌體時，準備變性鮭精DNA。沸水浴中煮10 min，隨后立即插冰上備用。
5. 將培養好的細胞轉入50 mL離心管中。室溫，4000 rpm，5 min，收集細胞。
6. 棄上清，1/2體積無菌水重懸菌體。
7. 室溫，4000 rpm，5 min，收集細胞。棄上清，用1/5體積1×TE/LiAC重懸。
8. 室溫，4000 rpm，5 min，收集細胞。棄上清，用1/100體積1×TE/LiAC重懸。
9. 30℃，200 rpm，培養30 min（可縮短或取消）。
10. 準備轉化的質粒：將1 μg質粒DNA（共轉化時，兩種質粒各為1 μg）及2 μL 10 mg/mL的變性鮭精DNA加入2 mL離心管中，充分混勻，總體積不應超過10 μL。
11. 加入100 μL酵母感受態細胞并輕輕混勻，30℃，200 rpm，培養30 min（可縮短或取消）。
12. 加入600 μL PEG/LiAC溶液（40% PEG，1×LiAC，1×TE）。輕輕吹打混勻。30℃，200 rpm，培養30 min-90 min。
13. 加入70 μL DMSO，輕輕顛倒混勻。
14. 42℃水浴中熱激10 min。冰上放置2 min。
15. 室溫，4000 rpm，離心2 min。棄上清，加100 μL無菌水重懸細胞。
16. 將細胞懸液各取一半涂于SD/-Trp-Leu和SD/- Trp-Leu- Ade-His平板上。
17. 28℃培養一周后觀察并拍照。
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