細胞永生化技術(shù)服務(wù)

研究背景

正常組織來源的細胞在體外培養(yǎng)條件下可分裂生長，但經(jīng)過有限次數(shù)的傳代后，就會停止增殖，發(fā)生衰老和死亡，這種現(xiàn)象稱之為海弗利克極限。有的細胞自發(fā)或受外界因素的影響，可以從增殖衰老危機中逃離，從而擁有無限增殖的能力，該過程稱之為細胞永生化。然而自發(fā)永生化的幾率非常小，嚙齒類動物為10-5-10-6， 而人類細胞則更為罕見， 小于10-12。通過轉(zhuǎn)染技術(shù)將外源性永生化基因?qū)肽康募毎蛘T導衰老相關(guān)基因突變，可以增加永生化的發(fā)生率，從而建立穩(wěn)定的永生化細胞株。

技術(shù)簡介

細胞永生化(Cell immortalization)是指體外培養(yǎng)的細胞經(jīng)過自發(fā)的或受外界因素的影響從增殖衰老危機中逃離，從而具有增殖能力的過程。正常組織來源的細胞在通常的體外培養(yǎng)條件下可分裂生長，但經(jīng)過有限次數(shù)的傳代后，就會停止增殖，發(fā)生衰老和死亡。利用基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)將外源性永生化基因?qū)肽康募毎麅?nèi)，從而建立永生化細胞株，以達到使體外培養(yǎng)的細胞具有增殖能力且細胞間無差異的目的。對細胞永生化進行深入研究，不只是有利于我們了解細胞增殖與衰老的分子機制，而且為探尋腫瘤治療及器官移植的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。此外，由于永生化細胞具有可以多次傳代的特性，可以利用各種細胞永生化的方法使那些傳代困難、增殖緩慢、容易衰老的細胞獲得永生，從而為研究人員提供許多的細胞資源，為科學研究提供了良好的體外細胞模型。

哺乳動物細胞使用幾種方法誘導細胞永生化。其中猿猴病毒40(SV40)T抗原和hTERT病毒誘導的細胞永生化最為簡單可靠，應(yīng)用廣泛。

為什么要做細胞永生化

許多細胞永生化技術(shù)可以在體外為細胞系提供擴展的增殖能力，同時密切模擬體內(nèi)細胞的生理學。與原代細胞不同，永生化細胞不易受復制衰老的影響，減少了重新購買和重新啟動生長的需要，節(jié)省了時間和費用。

? 定制永生化服務(wù)產(chǎn)生的細胞系壽命更長，通常與原代親本細胞相似

? 細胞永生化服務(wù)相結(jié)合，能夠克服原代細胞有限的壽命

? 除了標準細胞認證測試，可以測試永生化細胞系的擴展增殖能力和從感興趣的組織中選擇表型標記(例如，hTERT的持續(xù)表達)

永生化細胞具有增殖能力，并具有與親本組織相似或相同的基因型和表型，能夠提供穩(wěn)定均一、性狀一致的細胞來源，其意義主要包括但不限于

?了解細胞生長規(guī)律，探索細胞衰老機制；

?體外研究細胞增殖、分化、調(diào)亡等的理想模型；

?有助于明確致癌物質(zhì)的作用機制；

?體內(nèi)外探究腫瘤發(fā)生機制的重要模型；

?為研究者提供更多且更豐富的細胞資源等。

操作流程

服務(wù)內(nèi)容

原代細胞分離純化

永生化基因的慢病毒制備

慢病毒感染原代細胞并進行培養(yǎng)

永生化混合細胞進行抗生素篩選

永生化細胞系進行端粒酶基因表達和衰老檢測

服務(wù)流程

客戶提供：原代細胞、干細胞、免疫細胞材料，您可以提供自主分離的特定原代細胞，也可以從我們的原代細胞產(chǎn)品中選擇合適的目的細胞。

我們提供：建立永生化細胞株，以及提供建立方法，步驟及結(jié)果。

也可提供表型和功能的驗證：永生化細胞系可以根據(jù)您的要求進行表型和功能的驗證， 包括mRNA表達，蛋白質(zhì)表達或功能測定。

周期：4-8 周

報價：15000 元/株

公司優(yōu)勢

團隊擁有成套完善的技術(shù)體系，進行穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建

制備的永生化細胞系純度高，無污染

提供完整并準確的鑒定方案，鑒定報告真實可靠

擁有低成本、高效率的制備模式，極大縮短生產(chǎn)周期

項目案例

細胞永生化方法

細胞永生化的機制主要包括：理化因素作用所致的原癌基因活化/抑癌基因失活;端粒酶的穩(wěn)定活化；具有致瘤性的病毒如SV40病毒、EB病毒、人乳頭狀瘤病毒HPV等。

一般而言，自發(fā)永生化的幾率非常小，因此基于細胞永生化的機制，常通過轉(zhuǎn)染技術(shù)人為地將外源性永生化基因?qū)肽康募毎驅(qū)σ职┗蜻M行敲除，或誘導永生化相關(guān)基因突變以增加永生化的發(fā)生率，從而建立穩(wěn)定的永生化細胞株。

病毒基因轉(zhuǎn)染

很多病毒感染能夠誘導細胞永生化，例如EB病毒(epstein-barr virus, EBV)、猿猴病毒40 (simian virus40, SV40)和人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)。這些病毒感染其天然宿主細胞，能誘導細胞永生化。

EBV能使B淋巴母細胞永生化形成淋巴母細胞樣細胞系，它是通過潛伏蛋白激活細胞因子與其受體相互作用的途徑使細胞永生的。EBV永生化B細胞的一個最顯著的特點是端粒酶活性的提高，這可能是導致B細胞永生的主要原因。目前，EB病毒介導的細胞永生化應(yīng)用最多的是B淋巴細胞，其他細胞中的應(yīng)用很少。

SV40是簡單的真核細胞病毒，SV40的T抗原片段是最常用的目的片段，將其整合入靶細胞核內(nèi)并表達，可導致細胞增殖活力的改變并表現(xiàn)出多種與腫瘤相關(guān)的轉(zhuǎn)化顯型。應(yīng)用的方法包括：野生型SV40病毒共培養(yǎng)感染靶細胞、磷酸鈣法、電穿孔以及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法等。

HPV已成功將人的包皮細胞、角化上皮以及乳腺、胰導管和口腔等的上皮細胞永生化。HPV病毒的早期表達蛋白E6和E7在細胞永生化中起決定性作用。E6和E7蛋白能夠改變細胞的終末分化，誘導細胞進入S期，使細胞繞過正常細胞的周期檢查點。

病毒法獲得的永生化細胞往往發(fā)生細胞表型改變，而且一般只應(yīng)用于病毒 的特定宿主細胞。由于該法將整個病毒基因組導入了細胞，因此，很容易使細胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細胞。

端粒酶激活

端粒酶是一種能延長端粒末端的核糖核蛋白酶，由RNA和蛋白質(zhì)組成。端粒酶能以自身的RNA為模板，從端粒DNA3’-OH 末端延伸端粒或合成新的端粒DNA， 以補償細胞分裂時染色體末端的縮短，從而維持端粒的長度，使細胞不會因端粒耗盡而出現(xiàn)凋亡。正常情況下，大多數(shù)體細胞端粒酶的表達是嚴格調(diào)控的，表達是瞬時和低水平的。在原代培養(yǎng)的細胞中穩(wěn)定表達人端粒酶催化亞基(hTERT)基因能穩(wěn)定端粒的長度，使細胞易于永生化，因此hTERT的激活是細胞永生化的重要步驟。雖然激活端粒酶活性能夠使多種人和動物的細胞永生化，但是對于有些細胞，重建端粒酶活性并不足以使細胞永生化，還需要借助癌基因法。

癌基因法

一些原癌基因，如Myc, c-Jun, c-Ias, vsrc和Mdm2，通過基因轉(zhuǎn)染可介導目的細胞永生化。c-Myc是最早被發(fā)現(xiàn)的原癌基因，有許多與瘤化相關(guān)的功能區(qū)域，其轉(zhuǎn)錄表達的蛋白通過核膜進入細胞核與端粒酶的啟動子結(jié)合位點特異性結(jié)合，誘導端粒酶mRNA快速表達，直接激活端粒酶活性，促進細胞進入永生化。

細胞永生化過程中，抑癌基因如p53, pRb, BRCA1, DPC4等，通過等位基因隱性作用、抑癌基因的顯性負作用等逐漸失去活性，細胞老化途徑受阻。實驗證明端粒酶的活性與抑癌基因表達產(chǎn)物的下調(diào)有相關(guān)關(guān)系，推測抑癌基因的失活協(xié)同端粒酶的激活共同參與細胞永生化進程。

目前有多種細胞永生化的方法，但不是每一種方法都可使一個特定的細胞 永生化。由于細胞的來源動物、組織不同，其細胞的增殖、分化調(diào)控也不盡相同，因此，每類細胞的永生化的分子機制不同，其永生化細胞的方法也不同。