植物科學(xué)新技術(shù) 植物透明化試劑 
ClearSee?
ClearSee? 是一種僅需固定、洗凈、透明化三步簡單操作即可實現(xiàn)植物組織透明化的試劑。作為植物科學(xué)的研究工具，期待可以闡明細胞水平的現(xiàn)象和整個個體之間的系統(tǒng)聯(lián)系。
HP數(shù)據(jù)：由名古屋大學(xué)大學(xué)院理學(xué)研究科 栗原大輔特任助教、水多陽子研究員提供
◆操作步驟
使用 ClearSee? 的透明化方法，只需1）固定、2）洗凈、3）透明化三個步驟。詳細方法可參考隨產(chǎn)品附贈的使用說明書。
以下，是擬南芥葉和幼株的使用案例。
1. 固定
① 使用4%甲醛溶液固定樣本*1。
② 將樣本放入干燥機中，用真空泵減壓，在室溫下靜置30分鐘，并固定。
② 以上操作重復(fù)兩次。
② 為了防止植物樣品在減壓過程中飛出，建議打開管蓋，用封口膜密封，并用針在上面扎孔*2,3。
2. 洗凈
去除固定液，加入1 mL的1×PBS緩沖液，靜置1分鐘。然后去除1×PBS緩沖液，重新加入1 mL的1×PBS緩沖液，靜置1分鐘。
以上操作重復(fù)兩次。
3. 透明化處理
去除1×PBS緩沖液，添加1.3 mL的ClearSee?。
打開管蓋后用封口膜密封，并用針在上面扎孔。放入干燥機中，用真空泵減壓，并在室溫下靜置1小時。
取下封口膜，蓋好管蓋。避光，室溫靜置，透明化*4。
如有需要可更換新的ClearSee?。
4. 透明化過程
圖4. ClearSee?中的擬南芥葉和幼株
圖5. 可以觀察到樣本周圍葉綠素（1-2天后）
圖6. 更換新的 ClearSee? 后的樣本
圖7. 透明化的擬南芥葉和動株（3-5天后）
使用ClearSee? 進行透明化需要的物品
1. 高壓滅菌鍋 2. 局部排氣系統(tǒng)（通風(fēng)室等） 3. 真空泵 4. 干燥機 5. 60°C 恒溫器 6. 熒光顯微鏡 7. 錐形管 | 8. 微量離心管 9. 封口膜 10. 針 11. 鑷子 12. 蓋玻片 13. 載玻片 14. 凡士林油 |
注意
※ 由于植物活體樣本含有空氣，添加溶液時植物就會漂浮起來。請盡可能地將植物樣本浸入固定液中。
※ 請將干燥機設(shè)定在-90 kPa左右。根據(jù)植物樣本的不同，有時減壓會過強。減壓過強的話，會破壞植物組織和細胞。開始減壓后，由于會抽出植
※ 物樣本中的空氣，會產(chǎn)生氣泡。為了讓氣泡消失，請緩慢調(diào)整減壓的壓強。
※ 從減壓狀態(tài)恢復(fù)至大氣壓強時，請緩慢進行。如果急速恢復(fù)至大氣壓強的話，會破壞植物組織和細胞。
※ 透明化的時間根據(jù)植物種類和組織而異，請參照以下的時間。
※ 根：1~2天、葉和幼株：4~7天、雌蕊：2周、成熟組織：4周。
◆觀察案例
5. 觀察
在載玻片上用凡士林或油脂制作一個圍欄，放入適量 ClearSee?，用鑷子將樣本移入，蓋好蓋玻片，并用熒光顯微鏡觀察。由于 ClearSee?干燥后會產(chǎn)生沉淀，所以用凡士林或油脂來防止其干燥。觀察結(jié)束后，可以將植物樣本放回裝有 ClearSee? 的微管中進行保存。
另外，用 ClearSee? 透明化的樣本亦可用熒光色素進行染色。細胞核染色時，向 ClearSee? 中添加終濃度為 10 μg/ mL 的雙苯甲酰亞胺 H33258 三鹽酸鹽，雙苯甲亞胺 H33342 或 DAPI，細胞壁染色時，使用終濃度為 1 mg/mL，靜置１小時后，更換新的 ClearSee? ，再靜置１小時后，在熒光顯微鏡下進行觀察。
圖8. 經(jīng)透明化處理的擬南芥葉在明場中呈透明狀態(tài)，葉綠素的紅色自發(fā)熒光消失。
圖8. 由于可以對整片葉進行觀察，因此也可以觀察到維管束內(nèi)的熒光蛋白。比例尺為 200 μm。
圖9. 使用 ClearSee? 透明化的完整的雌蕊的熒光觀察。
圖2. 用４個顏色（藍色，綠色，黃色，紅色）的熒光蛋白標(biāo)記花粉管。
圖2. 根據(jù)參考文獻改編轉(zhuǎn)載。
圖10. 使用 ClearSee? 處理４天的擬南芥的根。
圖10. 生長素應(yīng)答細胞的細胞核用綠色、全身的細胞核用紫色顯示。
圖10. 根據(jù)參考文獻改編轉(zhuǎn)載。
■其他植物的透明化案例
使用 ClearSee? 透明化６天后的藍豬耳、矮牽牛、煙草、番茄、黃瓜、稻葉。
稻葉在透明化時，由于葉子的表面有蠟層，因此很難將溶液滲入組織里，通過在氯仿等有機溶劑中浸泡 10~30 秒除蠟后，開始固定的步驟。
圖11. 使用 ClearSee? 透明化的各種植物葉片（６天后）
◆參考文獻
Kurihara, D. et al.: Development, 142, 4168-4179 （2015）.
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| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品等級 |
| 031-25151 | ClearSee? | 50 mL | 植物透明化用 |
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